Co je polymerázová řetězová reakce (pcr)? fakta o zkoušce, kroky a použité

Co je to PCR (polymerázová řetězová reakce)?

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je technika, která se používá k amplifikaci stopových množství DNA (a v některých případech RNA) lokalizovaných v nebo na téměř jakékoli kapalině nebo povrchu, kde mohou být uloženy řetězce DNA. Klíčem k pochopení PCR je vědět, že každý člověk, zvíře, rostlina, parazit, bakterie nebo virus obsahuje genetický materiál, jako jsou sekvence DNA (nebo RNA) (nukleotidové sekvence nebo části DNA nebo RNA), které jsou jedinečné pro svůj druh, a jednotlivému členu tohoto druhu. V důsledku toho, pokud vzorek obsahuje segmenty DNA nebo RNA, je PCR metoda použitá k amplifikaci (vytvoření mnohem více identických kopií) těchto jedinečných sekvencí, takže mohou být použity k určení s velmi vysokou pravděpodobností totožnosti zdroje (a konkrétní osoba, zvíře nebo patogenní organismus) stopové DNA nebo RNA nalezené v nebo na téměř jakémkoli vzorku materiálu.

PCR amplifikace je však pouze částí identifikačního testu. Jakmile je amplifikace provedena (viz níže), musí být amplifikované segmenty porovnány s jinými nukleotidovými segmenty ze známého zdroje (například konkrétní osoba, zvíře nebo patogenní organismus). Toto srovnání jedinečných segmentů se často provádí umístěním PCR-generovaných nukleotidových sekvencí vedle známých nukleotidových sekvencí od lidí, patogenů nebo jiných zdrojů do separačního gelu. Elektrický proud prochází gelem a různé nukleotidové sekvence vytvářejí pásy, které se podobají „žebříku“ podle jejich elektrického náboje a molekulové velikosti. Toto se nazývá gelová elektroforéza. Pásy nebo kroky podobné žebříku, které migrují na stejné úrovně v gelu, vykazují identitu nukleotidových sekvencí. Tato metoda je jedním z nejpopulárnějších způsobů, jak jsou testy PCR dokončeny (viz obr. 1).

Obrázek 1, Pásy nebo "ladder" podobné kroky PCR vytvořené DNA Mycobacterium (se svolením CDC)

Postava. Opakující se prvky (Rep) –PCR (A) a gelová elektroforéza na pulzním poli (PFGE) (B) izolátů Mycobacterium cosmeticum od 2 pacientů v Ohiu a 1 pacienta ve Venezuele. Rep-PCR byla provedena pomocí primeru BOXA1R (3) a PFGE byl proveden s restrikčním enzymem AseI. Dráhy 1, 2, Ohio izoluje OH1 a OH2; dráhy 3, 4, kontrolní kmeny ATCC BAA-878T a ATCC BAA-879; pruh 5, venezuelský izolát VZ1. Standardy velikosti DNA jsou 100 bp (S1) a 48, 5 kb marker (S2).

Jak se provádí PCR (polymerázová řetězová reakce)?

V roce 1983, Kary Mullis přišel na základní kroky k amplifikaci DNA sekvencí. On a Michael Smith získali Nobelovu cenu za vývoj tohoto postupu v roce 1993. Existuje několik základních kroků, které jsou sledovány postupně; PCR lze provést v jedné zkumavce s vhodnými chemikáliemi a speciálně navrženým ohřívačem. Potřebná činidla nebo chemikálie jsou následující:

• Vzorek, který obsahuje nukleotidovou sekvenci (z krve, vlasů, hnisu, škrábání kůže atd.)
• DNA primery: krátká jednořetězcová DNA, která se váže na nukleotidové sekvence, které podporují syntézu komplementárního řetězce nukleotidů
• DNA polymeráza: enzym, který, když se DNA váže na primer, klesá po segmentu DNA a připojuje stavební bloky DNA k vytvoření komplementárních párů bází, a tak syntetizuje komplementární nukleotidové vlákno DNA (zavedení DNA polymerázy odolné vůči teplu, Taq polymeráza, odvozená z tepelně odolných bakterií, výrazně zlepšila schopnost provádět PCR)
• V roztoku je přítomen velký nadbytek stavebních bloků DNA nazývaných nukleotidy (adenin, thymidin, cytosin a guanin, zkráceně: A, T, C a G). Když jsou tyto bloky spojeny dohromady, tvoří nukleotidovou sekvenci nebo jediný řetězec DNA. Když tyto stavební bloky vážou své komplementární stavební bloky slabými vodíkovými vazbami (například A se bude vázat pouze s T a G pouze s C), vytvoří se komplementární DNA nukleotidová sekvence a naváže se na původní jednovláknovou DNA. Když je vazba dokončena, vytvoří se ve specifické sekvenci komplementární dvouřetězcová DNA.

PCR pak začíná segmentem DNA ze vzorku, který je umístěn do zkumavky s reagenty uvedenými výše. Roztok se zahřeje na teplotu nejméně 94 ° C (201, 2 ° F); toto teplo narušuje vodíkové vazby, které umožňují tvoření komplementárních řetězců DNA, takže ve směsi existují pouze jednotlivé řetězce (to se nazývá denaturace dvouřetězcové DNA).

Směs se nechá ochladit na asi 54 ° C (129, 2 F). Při této teplotě se primery DNA a DNA polymeráza vážou na jednotlivé jednořetězcové DNA (to se nazývá žíhání DNA). Protože stavební bloky jsou ve směsi v nadbytku (vysoká koncentrace), polymeráza je používá k vytvoření nových komplementárních řetězců DNA (nazývané prodloužení DNA) a tento proces je rychlejší při 72 ° C (161, 6 F). Tento proces vytvoří novou dvouřetězcovou molekulu DNA z každého jednotlivého řetězce původní molekuly.

Tento cyklus se opakuje asi 40krát ve stroji označovaném jako termální cyklovač, který automaticky opakuje cykly zahřívání a chlazení, přičemž množství každé sekvence DNA se zdvojnásobí při každém dokončení cyklu zahřívání a chlazení. To, co bylo původně jediným krátkým segmentem DNA, lze po 40 zdvojovacích cyklech zesílit na přibližně 100 miliard kopií.

Proč by měl lékař objednat test PCR (polymerázová řetězová reakce)?

Test PCR tvoří základ řady testů, které mohou odpovědět na mnoho různých lékařských otázek, které pomáhají lékařům diagnostikovat a léčit pacienty. Například testy PCR mohou detekovat a identifikovat patogenní organismy u pacientů, zejména těch, které se obtížně kultivují (například HIV a další viry a některé houby).

Ostatní lékaři objednávají testy PCR, aby pomohli diagnostikovat genetická onemocnění, zatímco jiní lékaři používají PCR k detekci biologických vztahů, jako je identifikace rodičů dětí. Testy PCR se také používají k identifikaci a charakterizaci genetických mutací a přeskupení nalezených u některých druhů rakoviny.

Testy PCR však byly modifikovány a rozšířeny do mnoha aspektů vědeckých výzkumů, včetně evoluční biologie, genetického otisku prstu, forenzního vyšetřování a mnoha dalších.

Co je RT-PCR?

RT-PCR je test PCR určený k detekci a měření RNA. Ačkoli počáteční PCR testy amplifikovaly DNA, mnoho virů a dalších biologických složek (například mitochondrie) využívá RNA jako svůj genetický materiál. RT-PCR se liší od konvenční PCR tím, že nejprve vezme RNA a převede řetězec RNA na řetězec DNA. To se provádí v podstatě stejným způsobem pro PCR popsaným výše, s výjimkou použití enzymu nazývaného reverzní transkriptáza místo DNA polymerázy. Reverzní transkriptáza umožňuje translaci jednoho řetězce RNA do komplementárního řetězce DNA. Jakmile tato reakce nastane, lze k amplifikaci DNA použít rutinní metodu PCR. RT-PCR byla použita k detekci a studiu mnoha RNA virů.

RT-PCR by neměla být zaměňována s jinou variantou PCR, nazývanou PCR v reálném čase. Real-time PCR je varianta PCR, která umožňuje analýzu amplifikované DNA během obvyklých 40 cyklů postupu. Ačkoli je postup podobný s konvenčními PCR s cyklováním, PCR v reálném čase používá fluorescenční barviva připojená k některým stavebním blokům nebo malým nukleotidovým řetězcům. V závislosti na použité metodě nastává fluorescence, když se vytvoří amplifikovaná vlákna DNA. Množství fluorescence může být měřeno během 40 cyklů a umožňuje vědcům měřit specifické produkty a jejich množství během amplifikačních cyklů. To často umožňuje zkoušejícím nebo laboratorním technikům přeskočit gelovou elektroforézu nebo jiné sekundární postupy potřebné pro analýzu produktů PCR, čímž se získají rychlejší výsledky.

Real-time PCR a RT-PCR jsou variace nebo modifikace původního testu PCR. Existuje však mnoho dalších variací (nejméně 25), které se používají k řešení konkrétních problémů. Všichni mají různá jména, například Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR a mnoho dalších.

PCR bude pravděpodobně nadále upravována, aby pomohla odpovědět na jakékoli další otázky v medicíně, biologii. a dalších oborů.